（全文）KCNE1基因敲出后构成的长QT
KCNE1基因敲出后构成的长QT综合征5的小鼠模型室性心律失常的产生机制
KCNE1基因编码的膜转运蛋白组合构成的K+通道调理着缓慢K+电流，KCNE1基因的突变引发的K+电流改变与长QT综合征5的心脏动作电位的延长和心室心律失常的产生有着密切的联系。我们首次展现了Langendorff灌注的KCNE1-/-鼠心左室心内膜和心外膜的单相动作电位（MAPs），并同步记录了其潜伏的致心律失常的特性：KCNE1-/-组（1）心外膜(57.1±0.5mscf.36.1±0.07msinwild-type(WT),P0.;n=5)和心内膜(54.4±2.4mscf.48.5±0.3ms,P0.05;n=5)动作电位复极化90%（APD90）的时程延长。（2）负的跨壁复极化梯度（离散度）（?APD90：内膜?APD90-外膜?APD90）(?2.5±2.4ms,vs12.4±1.1msinWT,P0.;n=5)。（3）心外膜初期后除极（EADs）和自发性室性心动过速（VT）的发生率为80%（4/5），WT组（n=5）为0。在连续性室性起搏中断后EADs产生格外频繁。（4）KCNE1-/-组（n=5）期前刺激后产生的单形性VT波持续时间为1.36±0.2s，WT组（n=5）并未产生单形性VT波。（5）心外膜的APD交替。KCNE1-/-组使用含1μM硝苯地平的台式液进行灌注，其引发的可能的抗心律失常的改变包括：（1）恢复了延长的心外膜APD90（从57.1±0.5ms到42.3±0.4ms,P0.;n=5）。（2）改变了?APD90的值(11.2±2.6)，让其更接近WT组(P0.05;n=5)。（3）抑制自主搏动和室性起搏中断后EAD的构成，使其与WT组（n=5）的特性类似。(4)抑制程控电刺激（PES）所引发的VT。（5）抑制APD交替。这些研究表明在KCNE1-/-组减少的预期的K+外流能引发心律失常，而通过抑制L型Ca+离子的内流可以终止其引发的心律失常。
得了长QT综合征的个体产生室性心动过速（VT）和心源性猝死的风险更大（Cammetal.）。长QT综合征是由于基因突变引发的，根据此理论已成功地构建了几种长QT综合征的转基因动物模型包括：LQT1(KCNQ1)(Casimiroetal.2),LQT2(HERG)(Babijetal.),LQT3(SCN5A)(Nuyensetal.2),LQT4(ANK-2)(Mohleretal.),LQT5(KCNE1)(Vetteretal.),LQT6(KCNE2)(Roepkeetal.)andLQT7(KCNJ2)(Luetal.)。KCNE1基因编码一种单向跨膜转运蛋白与6-跨膜转运蛋白组合为IKs，IKs是一种延迟整流离子通道(Sanguitietal.)。6-跨膜转运蛋白是KCNQ1编码的构成了K+通道的低导电元件：α和β亚基。减少的IKs可能与KCNE1突变有关，并与LQT5特点性的心脏动作电位的延长和室性心律失常的产生有关(Splawskietal.;Duggaletal.)。
减少的IKs的表型前期已在的几种鼠模型上进行了研究。由于严重的结构和功能的异常，基因敲出的纯合KCNE1或KCNQ1小鼠表现出双侧感觉性耳聋和旋转式运动(Vetteretal.;Dricietal.;Kupershmidtetal.;Leeetal.;Casimiroetal.2)。但是根据心脏的表型并不能很好的肯定基因型。确切长QT间期异常是根据KCNE1-/-组的鼠体表ECG记录的心率的改变来肯定的(Dricietal.)，但是其它组不但在体表ECG的记录上没有明显异常(Kupershmidtetal.)而且用微电极记录的KCNE1-/-组的鼠孤立的右心室楔形块的动作电位的时程（APD）也没有显著差异(Charpentieretal.)。另外，在敲出了KCNQ1基因的平静小鼠体表ECG普遍显示异常，而观测的此鼠离体心脏的心内膜和心外膜的单相动作电位（MAPs）却没有显著差异(Casimiroetal.2)。
虽然有如此相互矛盾的报导。但从全部心脏的改变方面来看，能观测到KCNE1-/-组的心房(Templeetal.)和心室(Tosakaetal.)和KCNQ1-/-组的心室(Balasubramaniametal.)心律失常的产生。而且根据运用特点性辨认折返激动的改进PEFA丈量工具对KCNE1组离体灌注心脏的观测可以推测触发机制可能是心律失常的产生的基质(Balasubramaniametal.;Roden,;Saumarezetal.)，而视察应用二氢吡啶类L型钙离子拮抗剂硝苯地平灌注心脏的抗心律失常的效果(Balasubramaniametal.)能进一步支持这类推测。
在本实验中，我们相应的延伸了Balasubramaniametal等人的研究（）即首次同步丈量了心外膜和心内膜的MAPs并研究了KCNE1组离体灌注心脏在使用不同药物下进行程控电刺激（PES）的反应。首先，我们证实了与心律失常产生基质相干的可能电学特性包括：（1）心内外膜间复极离散度的改变。（2）心内外膜动作电位时程的延长，此特性与（1）有一定联系。（3）动作电位交替。接着，我们首次记录了离体灌注KCNE1-/-心脏的初期后除极（EADs）和触发心律失常。最后，我们延伸了前期的研究，首次通过记录硝苯地平对已改变的电学特性的影响预测硝苯地平发挥的抗心律失常作用，以此来描写在KCNE1组使用二氢吡啶类L型钙拮抗剂硝苯地平灌注心脏的抗心律失常的效果(Balasubramaniametal.)。而其中硝苯地平发挥的抗心律失常作用是通过作用于内流的Ca2+产生的效应，这与预计的KCNE1组减少外流离子的效应相反。
方法
实验动物
KCNE1小鼠是由/sv系小鼠繁育的，具体的方法详见Vetteretal()的文章.我们实验室的饲养的纯合的KCNE1-/-和WT小鼠有专门的供应线（渠道）。KCNE1-/-小鼠表现出与人的表型类似的旋转运动行动和感觉性耳聋，但是与WT型小鼠的死亡率是一样的，而KCNE1-/-系这些遗传学特性的改变早已有文献进行了详细的描写(Nerbonneetal.2;WarthBarhanin,;London,;Napolitano,)。所有的小鼠饲养在室温（21±1℃）的动物房中，光暗循环周期为12h，给予充足的无菌啮齿类动物的食品和水。实验使用的雌雄鼠月龄大概为6个月。
Langendroff灌注心脏的准备
获得鼠心的步骤遵守自年实行的英国动物规章1(ScientificProcedures)，在不进行麻醉的情况下进行快速的颈椎脱臼处死小鼠并取下心脏放入冰冷的含碳酸氢盐缓冲的台式液(mm:NaCl,NaHCO,KCl4,KH2PO41.2,MgCl21,CaCl21.8,葡萄糖10，丙酮酸钠2,pH7.4)中，使用95%O2–5%CO2气体进行氧合(Balasubramaniametal.)。在缓冲液表面用特制的预冲了冰冷的缓冲液的21号插管插入主动脉1小段距离（mm），然后使用通过μm和5μm过滤器(Millipore,Watford,UK)的台式液用蠕动泵(Watson-MarlowBredelmodelS,Falmouth,Cornwall,UK)进行速度为.n-1的逆行灌注，其中台式液加热至37℃是通过水箱和循环器(TechnemodelC-85A,Cambridge,UK)进行的。
实验使用的心脏是健康的有活力的，在升温后心脏出现出均一的粉红色和自主性的收缩。为了避免进行PES（）下假阳性的出现，没有以上特点的心脏立即抛弃（1/11的心脏由于未进行恰当的插管及随后局部灌注不足而抛弃）。实验前用缓冲液（台式液）进行20min的生理性灌注。
单相动作电位的记录
自主安置在心脏表面记录MAPs的电极(LintonInstruments,HarvardApparatus,UK)是购买的有弹簧支持的AgCl材质的(尖端直径2mm)。心内膜特制的电极是由以聚四氟乙烯外壳(0.25mmdiameter)绝缘两条相互缠绕的银丝(99.99%purity)构成的(AdventResearchMaterialsLtd,UK)，电极通过室间隔上开的一个小孔插入左心室同时旋转电极至其与左心室游离缘接触。自主安置的内膜电极是通过一个特制的磁柄连接固定在一个金属盘上的。适用于鼠记录信号放大和低通滤波的设置为0.1Hz到1.0kHz(GouldS,Gould-NicoletTechnologies,Ilford,Essex,UK)，用+模数转换器进行数字化转换(CambridgeElectronicDesign,Cambridge,UK)。MAP波形分析使用的是spikeⅡ软件(CambridgeElectronicDesign)，结果以means±s.e.m.表示，不同实验组间比较分析使用方差分析(SPSS软件）。
程控电刺激
程控电刺激（PES）使用的是分别安置在左右心室表面基底的铂金双极(1mminterpolespacing)刺激电极和记录电极。最开始的起搏是依照振幅为2ms方波，BCL=ms,刺激强度为3倍刺激阈值(GrassS48stimulator,Grass-Telefactor,Slough,UK)，刺激时长20min.实验使用的小鼠均为系，它与C57小鼠类似，在程控电刺激的额外刺激（S2）引诱下产生心律失常的机率较FBV或BLACKSwiss动物(Maguireetal.)小。但是应当避免包括S3/S4额外刺激和迅速爆发刺激的起搏方案，以减少假阳性的结果出现(Maguireetal.)。
药剂
所有药物(Sigma-Aldrich,Poole,UK)初始浓度均调至为1mM。硝苯地平用96%的乙醇溶解，药物终究的浓度是用缓冲液稀释到达的。为了避免光降解，硝苯地平是用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱里。
结果
KCNE1-/-组心脏显示动作电位时程延长
本实验从KCNE1-/-组和WT组(n=5)心内外膜记录的同步MAPs都满足已知的鼠科单相动作电位的波形即基线安稳并具有典型的三角形的MAPs波形，其中WT组典型的三角形MAPs包括峻峭的上升支和短暂的平台期(Knollmanal.2)。KCNE1-/-组心外膜记录的MAPs较WT组显著延长并且有明显的平台期，而MAPs的延长在复极后期尤其显著。而此结论与其它的遗传改变的Ik减少的小鼠心室肌细胞上记录的动作电位的参数是相一致的(Xuetal.b;Brunneretal.2)(Fig.1A)。与此同时在KCNE1-/-组与WT组心内膜MAPs相比较的差异并没有它们心外膜比较的显著特点(Fig.1B)。
为了避免心率固有差异的影响，在平衡状态后设定BCL=ms的右心室的起搏并视察KCNE1-/-组和WT组心内外膜的MAPs并丈量APD30、APD50、APD70、APD90。每20min抽取10个MAPs组成4个数集并以此肯定APDs均数值。KCNE1-/-组（n=5）和WT组(n=5)随后的连续数集记录的APD值都是安稳的。
通过APD值可以观察到Fig.1A和B中数值动态的改变，其中与WT组相比KCNE1-/-组的APD30和APD50明显缩短，而APD70和APD90却显著延长。与WT组(P0.;n=5)相比KCNE1-/-组心外膜的APD30和APD50分别由6.6±0.01ms和14.0±0.02ms显著缩短为2.3±0.06和6.1±0.2ms，而与之相反的是心外膜的APD70和APD90分别由25.1±0.05ms和36.1±0.07ms延长为31.5±0.6ms和57.1±0.5ms(Fig.1C)。与WT组(P0.;n=5)相比KCNE1-/-组心内膜的APD30和APD50分别由7.9±0.01ms和14.8±0.03ms显著缩短为5.1±0.03ms和12.1±0.07ms。另一方面虽然与WT组(P0.05;n=5)相比KCNE1-/-组心内膜的APD90由48.5±0.3ms延长为54.4±2.4ms，但是APD70WT组（26.4±0.08ms）和KCNE1-/-组（26.8±0.2ms）没有显著差异(Fig.1D)。
Fiture1
KCNE1-/-组和WT组心内（B）外(A)膜的典型的单相动作电位。KCNE1-/-组（阴影栏）和WT组（空白栏）心内（D）外(C)膜相应的APD30、APD50、APD70、APD90的均数比较。**P0.和*P0.05表示KCNE1-/-组与WT组之间有显著差异。
KCNE1-/-组展现改变的空间复极离散度
已知复极的离散容易引发心律失常的临床表现(Restivoetal.)，这个结论在初期的心律不齐综合征的小鼠模型中有记载(Bakeretal.;Fabritzetal.b)。但是，正常情况下小鼠心脏的复极化有显著的区域异质性(Anumonwoetal.2;Knollmanal.2;Dillyetal.)，最近的文献报导这类特性实际上可能有抗心律失常的作用(Costantinietal.)。EADs能直接影响局部电异质性(Voldersetal.)。为了抑制EADs平衡灌注后设置右心室心外膜的起搏BCL=ms并记录相应的KCNE1-/-组的跨壁离散度。跨壁离散度的计算通过同时记录的左心室心内膜游离缘和心外膜MAPs的APD90差异（△APD90）减去心内外膜局部激活时间的差异（△AT）而得到的(OpthofCoronel,)。KCNE1-/-组内外膜(分别为14.8±0.5ms减去15.3±0.9ms,P0.05)和WT组内外膜（分别为14.6±1.4ms减去13.6±0.7ms,P0.05）的AT并没有显著差异。所以，跨壁离散度的计算只需要内外膜APD90相减就可以获得了。因此，KCNE1-/-组（n=5）的APD90的均数?2.5±2.4ms等于54.4±2.4ms减去57.1±0.5ms，WT组(P0.;n=5)的APD90的均数12.4±1.1ms等于48.5±0.3ms减去36.1±0.07ms(Fig.2)。
Figure2
KCNE1-/-组和WT组心内外膜APD90和APD90的均数比较
KCNE1-/-组抑制了初期后除极
在初期研究中，应用无线电遥测技术记录到了KCNE1-/-和KCNQ1-/-活体小鼠产生的期前收缩、非持续性的室性心动过速、房颤的现象(Tosakaetal.;Templeetal.)。Langendroff灌注的KCNE1-/-小鼠心脏在自主兴奋剂烟碱(μm)(Tosakaetal.)和程控电刺激（PES）(Balasubramaniametal.)下全产生了室速，但是产生室性心律失常的机制仍不清楚。
本实验中我们首次根据同步心内外膜的MAP记录的自律性活动揭露了KCNE1-/-组（n=5）有4/5的产生了自发性VT和心外膜频发的EADs(Fig.3AandB)，相比之下WT组发生率为0(Fig.3C).另外，在KCNE1-/-小鼠心脏视察的EADs与前期在LQTS模型上描写的EADs特性(Fabritzetal.a)存在显著的差异。EADs产生在复极的晚期（动作电位的相）但又在复极完全完成前，所以它是区分于延长后除极（DADs）的(Fig.3B)。上述的心外膜EADs是从n=10的23.9±9.7%的采样周期中的MAPs取得的。采样周期每一个延续10s并且任意的2个都是从KCNE1-/-组（n=5）的每个心脏总的20min记录时间里随机挑选出来的。而上述的这些现象在WT组(P0.05;n=5)全部实验进行的进程中并没有产生。在持续性心室起搏短暂的2.1±0.3s停顿后EADs产生尤其频繁，其中在KCNE1-/-组的最初5次自主起搏中发生率占80%（5个心脏中20次起搏停顿了16次）(Fig.3D)。相反在WT组恢复自主起搏的进程中并没有观察到EDAs产生，只是在持续性心室起搏停止后有一段相当短的停搏时间0.4±0.07s(Fig.3E)。虽然KCNE1-/-组有1个心脏表现出持续性自发的VT并且KCNE1-/-组其它的心脏自发性延续的时间为2.48±0.7s，但是除那1例持续性自发的VT外其余心脏在右心室BCL=ms起搏时都能终止EDAs和自发性VT的产生。与心外膜记录的结果不同，KCNE1-/-组（n=5）和WT组（n=5）的心内膜在自主搏动或是连续性起搏下都不产生EADs。
Figure3
KCNE1-/-组自主搏动下心外膜记录的典型的单形性MAP。所见的多个阈值下的初期后除极（EADs）*叠加能产生一个动作电位(箭头)（A）。当KCNE1-/-组两个连续的MAPs叠加时，EADs可以在第二个MAP完全复极化完成前的复极相观察到，所以它区分于延迟后除极（B）。WT组自主搏动下心外膜的实验记录中并不会出现EADs（C）。在自主心率停顿和连续性的心室起搏（最后的起搏显示在记录的开始）停住后KCNE1-/-组通常有EADs（*）和引发动作电位（箭头）产生（D）,WT组却不会产生（E）。
KCNE1-/-组心脏在程控电刺激下（PES）引发的单形性室速
前期转基因鼠的光学映照实验证明了转基因鼠减少的缓慢活动的K+电流（IKs）引诱产生的复极的空间离散和折返活动，使得期前刺激（S2）功能性的阻挠成为了程控电刺激（PES）引发VT的缘由(Bakeretal.)。一样的，在PES时KCNE1-/-组运用改进的PEFA显示出单向传导阻滞和折返激动的特点(Balasubramaniametal.)。但是Langendroff灌注的L型二氢吡啶类钙拮抗剂硝苯地平的显著抗心律失常作用并没有明显的改良潜伏的折返性基质，因此伴随产生了抗心律失常的触发机制的猜想(Balasubramaniametal.)。目前认为长QT间期下与EAD相干的触发激动引发了VT，而VT的保持是通过折返活动完成的(Yaal.2)。
在本次实验中，KCNE1-/-组在BCL=ms下，进行8次成串刺激和1次提早ms的右心室心外膜的期前刺激后引发构成了1.36±0.2s(n=5)短暂的单形性的非持续性VT(Fig.4A)。KCNE1-/-组室速波是一致的，CL均数为50.7±3.8ms(n=5)(Fig.4B,左)，频繁观察到在自主搏动下每一个没有进展为VT的偏转波的波形与EDAs很类似(Fig.4B,
右)。更重要的是直至VT自发性的终止，下一次去极化之前未回到基线的VT都有一个偏转(Fig.4A)。这些观测结果区分与其它遗传学改变的一样具有心律失常表现的小鼠所引发的VT，这些小鼠所引发的VT主要表现为最初单形性VT最后发展为多形性VT和更加典型的折返性激动(Bakeretal.;Fabritzetal.a)。确切在KCNE1-/-组和WT组并未观察到多形性的VT。
Figure4
在程控电刺激（PES）下KCNE1-/-组典型的心外膜单相动作电位（MAPs）。在BCL=ms下给予4次连续刺激后给予一次S1-S2间期为39ms的期前刺激（*），从而引发了CL=39ms的单形性非持续性的VT。在非持续性的VT自发终止后，EADs可能会在随后的2个自发搏动进程中产生（A）。仔细视察可以发现在下一次去极化之前每一个未能回到基线的VT波都有一个偏转（B,左图），这与在自主搏动心脏中常常观察到的不进展为VT的EADs类似（B,右图）。
KCNE1-/-组心脏显现出APD交替与APD恢复无关
在LQTS(Zarebaetal.)和相应的动物模型(Chinushietal.;ShimizuAntzelevitch,;Fabritzetal.b)中，空间异质性的APD交替引发的有效不应期离散可能是折返性激动(Weissetal.)产生的基质。Dricietal.报导在非控制性的条件下对KCNE1-/-小鼠（n=2）和WT小鼠(n=3)进行腹腔注射异丙肾上腺后，体表的ECG记录到了T波交替（KCNE1-/-组为1/2、WT组为2/3）(Dricietal.)。虽然本次实验KCNE1-/-组（n=6）和WT组(n=6)都进行了BCL=ms的延续右心室起搏，但通过连续丈量心内外膜APD90的差异仅首次观察到KCNE1-/-组心外膜产生了APD交替。Figure5A（左边图案）显示的是连续记录的KCNE1-/-组典型的心外膜MAPs，旁边的是常规10s记录的KCNE1-/-组每一个MAPs对应的APD90的图案（右边图案）。KCNE1-/-组每一次连续性的起搏都有一个肯定的APD90交替值，但是WT组却没有类似的特点，因此WT组变化的APD90图案区分于KCNE1-/-组（Fig.5B）。在KCNE1-/-组(n=6)观察到1例自发性VT，但WT组(n=6)未观测到。
Figure5
从KCNE1-/-组心外膜连续的单相动作电位（MAPs）的迹线可以清楚辨认出动作电位时程（APD）交替（A,左图）并且可以从随后随机挑选的10s采样周期的“锯齿”状APD/T图证实（A,右图）。WT组并没有相同的迹线和图形（B）。
硝苯地平缩短了动作电位并恢复了复极梯度
前期报导的KCNE1-/-小鼠心脏的研究应用PEFA丈量到L型钙离子通道拮抗剂硝苯地平并没有改良任何潜伏的折返激动的基质，此结论暗含了一个心律失常的触发机制(Balasubramaniametal.)。尤其是伴随Ca2+时，不管是L型的钙通道(ICa,L)还是钠钙交换体(INa–Caxc)都认为是引发EADs(ZengRudy,)的重要的内向电荷转运体(ZengRudy,)。前期研究表明，L型钙离子通道拮抗剂苯基烷胺类的维拉帕米能抑制LQTS动物模型(Aibaetal.;Milbergetal.)的EADs和VT并减少复极离散度，与临床视察的效应类似(Cosioetal.;Shimizuetal.;Komiyaetal.）但是它作用于Ca2+通道的同时也作用于K+和Na+通道(PidoplichkoVerkhratskii,;Chouabeetal.;Zhangetal.)。因此在本次研究中我们研究了KCNE1-/-组心脏灌注二氢吡啶类钙拮抗剂硝苯地平(Zhangetal.)的明确电生理效应。
首先，一方面，灌注了含1μM的硝苯地平台式液的KCNE1-/-组可以观察到：心外膜APD90由57.1±0.5ms显著地减少到42.3±0.4ms(P0.;n=5)(Fig.6A)，而心内膜APD90却没有明显改变(前后分别为54.4±2.4ms，53.4±1.6ms,P0.05;n=5)(Fig.6B)。另一方面，灌注了含1μM的硝苯地平台式液的WT组，在心内膜(前后分别为48.5±0.3ms和49.1±0.4ms,P0.05;n=5)和心外膜(前后分别36.1±0.07ms和40.8±0.1ms,P0.05;n=5)APD90并没有显著改变。KCNE1-/-组灌注L型钙离子拮抗剂后选择性的缩短心外膜APD与初期同时阻断了IKr和IKs(分别用E-和chromanolB)(Aibaetal.)的猫科动物动脉灌注的心室楔形块视察的结论类似。
接着，由于KCNE1-/-组灌注的含1μM的硝苯地平的台式液对心外膜APD90的影响可以推论其对△APD90有显著的影响。另外，灌注的含1μM的硝苯地平的台式液对KCNE1-/-组心内外膜(分别为12.6±1.2ms和13.7±0.9ms,P0.05)和WT组心内外膜（分别为13.8±0.8ms和12.2±1.2ms,P0.05）的AT没有显著区分。因此可以计算出硝苯地平灌注后KCNE1-/-组内外膜的△APD90均值恢复为11.2±2.6ms(53.4±1.6ms减去42.3±0.4ms)，而无心律失常产生的WT组内外膜的△APD90均值并没有显著改变成8.2±0.4ms（49.1±0.4ms减去40.8±0.1ms，P0.05;n=5）。
硝苯地平抑制了心律失常产生
在自主搏动和连续性的心室起搏突然终止时灌注含1μM的硝苯地平的台式液抑制KCNE1-/-组和WT组产生的全部EADs(Fig.6D).而且硝苯地平能抑制前期报导的KCNE1-/-组在PES下引发的VT，所以在期前刺激下硝苯地平灌注的KCNE1-/-组（n=5）无引发的VT产生(Fig.6E)。
Figure6
灌注和不灌注1μM硝苯地平的KCNE1-/-组典型心内膜（B或endo）和心外膜(A或epi)的单相动作电位。硝苯地平对KCNE1-/-组和WT组的影响可以通过心内外膜APD90均值(±S.E.M.)和△APD90值显示（C）。KCNE1-/-组硝苯地平的抗心律失常效果表现在能抑制自主搏动心脏心外膜全部的EDAs（D）。另外硝苯地平灌注后的KCNE1-/-组（n=5）在两次PES的期前刺激之间无引发的VT产生(Fig.6E)
鼠科的心室不应期（VERP）与心律失常的产生有关(Maguireetal.)，所以关于硝苯地平对心室有效不应期（VERP）的影响我们也进行了研究。VERP是从左心室外膜测得的最长S1-S2间期而不是从相应的ECG上测得的。其中KCNE1-/-组VERP均值为50±5.4ms(n=5)，WT组VERP均值为52.8±7.8ms(n=5;P0.05)。虽然没有统计学的显著差异(P0.05)，但是灌注硝苯地平后KCNE1-/-组和WT组的VERP均值分别为47.3±8.1ms和63.8±11.3ms(Fig.7)。
Figure7
KCNE1-/-组和WT组灌注1μM硝苯地平后对心室有效不应期（VERP）的比较
另外，硝苯地平的灌注完全抑制了仅在KCNE1-/-组心外膜记录到的APD交替(Fig.8A和B)。KCNE1-/-组△APD交替均值确切由7.42±1.2ms减少为2.67±0.9ms(P0.05;n=6)；WT组△APD交替均值变化不大，前后分别为1.5±0.3ms和1.6±0.4ms(Fig.9)。其中△APD的计算是遵照从KCNE1-/-组和WT组的每一个心脏的20min总记录中随机挑选出3个10s采样窗的连续内外膜MAPs进行的APD90差值计算。
Figure8
KCNE1-/-组灌注1μM硝苯地平后心外膜记录的抑制了APD交替的一系列单相动作电位（MAPs）(A,左图)，从随机挑选10s抽样间期的非锯齿状APD/T图的可以证实（A，右图）。在WT组连续的APD90变化与连续性心率并没有展现出交替效应（B）。
Figure9
KCNE1-/-组和WT组灌注1μM硝苯地平后，KCNE1-/-组△APD90(P0.05)显著减少了并接近于WT组的，但WT组的△APD90没有显著改变。
APD交替与APD恢复异常和Ca2+异常有关。虽然初期的KCNE1-/-小鼠心脏研究结果更支持Ca2+异常是引发APD交替的缘由(Pruvotetal.;Weissetal.)，但是我们应用的多种方法在KCNE1-/-组和WT组检测到APD恢复的异常。应用递减的起搏方案生成的S2APD90/舒张间期(DI)的恢复曲线可以用于评价心律失常偏向(Garfinkeletal.;Weissetal.)。由于鼠科缩短的动作电位和有效不应期使S2APD90和舒张间期(DI)难以丈量(Fig.10A)。因此我们采取了先绘制KCNE1-/-组（n=5）和WT组(n=5)S2APD90/（S1-S2间期）的恢复曲线(Fig.10A)，再在KCNE1-/-组（n=5）和WT组(n=5)应用替换方法：动作电位振幅(APA)/（S1-S2间期）重新估算恢复曲线(Fig.10B),其中替换方法已在类似的鼠类研究中得到确认(Bakeretal.)。两组中由于APD90基线的延长使得KCNE1-/-组的曲线平行且位于WT组上方，而恢复曲线都有轻微的向下倾斜这意味着缩短的S2APD与偶联间期接近(Fig.10C)。虽然两组所有案例的APD90S1-S2曲线线性拟合良好，R2的均值为0.58±0.1，但是通过S2APD90/(S1-S2间期)算的KCNE1-/-组与WT组的斜率均值(分别为0.±0.02versus0.1±0.04,P0.05,n=6)无显著差异；一样通过APA/(S1-S2间期)算的KCNE1-/-组与WT组的斜率均值(分别为0.99±0.99versus0.01±0.02,P0.05,n=6)无显著差异。另外，KCNE1-/-组灌注硝苯地平后的恢复曲线(S2APD90/S1–S2)的斜率均数(0.1±0.04,P0.05,n=6)并没有显著改变(Fig.10C)。
Figure10
KCNE1-/-组和WT组典型的心外膜单相动作电位（MAPs）和用于评估动作电位时程恢复的多种方法。由于鼠科缩短的动作电位和有效不应期，增加了丈量紧挨着S2APD90前的舒张间期（DI）和舒张间期（DI）的难度。KCNE1-/-组和WT组的S2APD90/（S1-S2）模式的恢复曲线是由BCL=ms，连续8次s1起搏后给予1次期前刺激（S2）的-1ms的递减起搏方案取得的（A）。也可以应用初期证实的方法，在-1ms的递减起搏方案取得APA/（S1-S2）模式的恢复曲线（B）。随后应用S2APD90/（S1-S2）方法构建的KCNE1-/-组（n=3）和WT组(n=3)的APDR曲线是线性倾斜的。但是检测的KCNE1-/-组和WT组基线的斜率均数和灌注和不灌注1μM硝苯地平的KCNE1-/-组（C）之间的基线斜率均数没有显著差异。
讨论
KCNE1基因能编码一种跨膜转运蛋白，该蛋白是缓慢型的钾离子通道（Iks）的组成成份。Iks属于延迟整流离子通道(Sanguitietal.)，它与在长QT5综合征中观测到的心脏动作电位的延长和室性心律失常的产生有关(Splawskietal.;Duggaletal.)。与之相应的是，在KCNE1基因敲出的小鼠中视察到了不同程度的心房和心室心律失常的表现(Kupershmidtetal.;WarthBarhanin,;Balasubramaniametal.;Templeetal.)。KCNE1基因在刚出身的幼鼠心室中高度表达(Dricietal.)，但在成鼠阶段其表达将快速下降到一个相对较低的水平(Felipeetal.;Xuetal.b)。虽然在初期的一些研究中KCNE1-/-小鼠没有显现出(Kupershmidtetal.)或唯一少数显现出(Charpentieretal.)心率失常的表现，但是Dricietal.()和其他团体在应用更灵敏的丈量心律失常产生偏向的方法下(Dricietal.;Balasubramaniametal.)报导称KCNE1-/-小鼠有明显的心律失常的表现，我们本次研究结果与Dricietal.()和其他团体的研究结果是一致的。虽然前期推测KCNE1-/-小鼠心脏产生室速的病理生理机制与触发活动和折返激动有关(Balasubramaniametal.)，但它产生的具体机制仍然其实不清楚，如果能确认具体的机制将可以与对应的临床病例比较(El-Sherifetal.)。因此本次研究了：（1）Langendroff灌注的KCNE1-/-小鼠心脏在PES下首次同时记录了心内外膜的MAPs。（2）KCNE1-/-小鼠心脏灌注的二氢吡啶类钙拮抗剂硝苯地平的抗心律失常作用对内流ICa和外流IK平衡的影响。其中硝苯地平抗心律失常的作用与维纳帕米不同，仅作用于Ca2+通道外而不会作用于Na+通道和K+通道(PidoplichkoVerkhratskii,;Chouabeetal.;Zhangetal.)。
首先，我们从完好的KCNE1-/-小鼠心脏上首次记录到同步的心内外膜MAPs的延长，其中预期的IKs减少的表现与遗传学改变的缺少H+通道的小鼠临床表现一样(Xuetal.a;Brunneretal.2)。这类MAPs的延长与初期研究的KCNE1-/-小鼠体表ECG显示的QT间期异常是相一致的(Dricietal.)。但是初期的研究表明WT小鼠心脏的APD有区域散布差异(Anumonwoetal.2;Knollmanal.2;Liuetal.;Dillyetal.)，这可能是由于成年WT鼠(C57BL6,FVBandSv)左心室心内外膜表达的K+通道(Kv4.2,Kv4.3,Kv1.5,Kv2.1)区域散布异质性的结果(Xuetal.b;Bruetal.)。尽人皆知小鼠左心室心外膜的Ito,f表达高于内膜(Bruetal.)，而另一方面的确IK的密度会伴随短暂迅速外流电流通道（Ito,f）的表达而增高，这可能是观察到的KCNE1-/-小鼠心脏心外膜APD选择性延长的缘由。
其他团体并没有报导KCNE1-/-小鼠体表ECG记录如上述的明显异常(Kupershmidtetal.)，用微电极记录的KCNE1-/-小鼠离体的右心楔形块实验中也没有报导内膜动作电位有显著的延长(Charpentieretal.)。一样，当在KCNE1-/-小鼠体表ECG记录到的广泛的异常时，而用这些小鼠的心脏进行离体灌注视察心内外膜的MAPs变化时却并未显示异常(Casimiroetal.2)。无论如何，在整体观察到的APD显著的区域差异，却没法从离体的心脏组织块(Charpentieretal.)或是细胞(Casimiroetal.2)的研究中得到证实。
其次，由于KCNE1-/-组心外膜APD选择性的延长，我们首次考虑到比较KCNE1-/-组和WT组的左室复极梯度差异。公认K+通道密度的异质性散布与功能性的复极梯度有关，其中功能性的复极梯度能完成同步复极并抑制折返激动(NerbonneGuo,)和引发心律失常(BurashnikovAntzelevitch,)。前期的鼠科研究中确切阐明增加(Londoal.;Bakeretal.)或减少(Costantinietal.)的复极梯度所引发的K+通道的改变增加了室性心律失常产生。
接着，我们通过首次记录KCNE1-/-小鼠EADs和自发性VT的产生频率证实了初期的推测(Balasubramaniametal.)。EADs仅能在心外膜观测到，而心内膜和心肌的特殊区域和负责传导的房室结、浦肯野纤维、记录收集处的心肌细胞都没有观测到。
另外，PES引发的片断重复触发活动致使KCNE1-/-全组产生了与多形性VT截然不同的单形性的非持续性的VT，更多典型的折返激动的机制在其它的鼠模型中有相应的描写（Bakeretal.;Fabritzetal.b)。在与LQT2（减少IKs）和LQT3(增加INa)相干的复极延长的实验条件下进行的实验已证实了EAD介导的触发活动与室性心律失常有关，而EAD介导的触发活动与室性心律失常的关系在LQT1和LQT5(减少IKS)中的角色仍是未知的(Voldersetal.)。在前期摹拟犬离体心室(BurashnikovAntzelevitch,)的Markov模型(SilvaRudy,)中已证实IKS可能是提供了一个“复极储备”，IKS能抑制以IKr为主的其它复极相干离子所引发的EADs和动作电位的延长。在前期几种遗传学改变的鼠模型中确切发现IKs选择性的减少与活体鼠的频发室性早搏和阵发性非持续性VT(Tosakaetal.)和离体灌注鼠心的引发激动的产生有关(Baleetal.)。
紧接着，我们仅从KCNE1-/-小鼠心外膜的MAPs上首次观察到APD交替。另外与前期的研究(Pruvotetal.;Waal.)符合，我们研究发现KCNE1-/-小鼠的APD交替与APD恢复异常无关，因此支持了APD交替与Ca2+的异常有关的观点。虽然已知在包括LQTS在内的多种心脏病中心律失常的产生与APD交替有关(Rosenbaumetal.)，但是明确的潜伏机制(电恢复或Ca2+异常)依然是受争议的(Pruvotetal.)。
最后，我们首次记录到KCNE1-/-组灌注1μM硝苯地平后的抗心律失常的效应与电生理改变是一致的。虽然有报导称10μM硝苯地平能特异性的阻断L型Ca2+通道(Yaoetal.)，也有报导称μM硝苯地平能抑制离体灌注鼠心的EAD(Liuetal.)，但是人们所认可的是在保持电压（在小于电压窗（阈）时L型Ca2+能再活化）为-40mV时ICa，L阻断的IC50为50μM。另外，有报导显示2μM硝苯地平能完全抑制离体兔心肌细胞的ICa,L(Hagiwaraetal.)，而且硝苯地平的浓度为5μM时也不影响ICa,T、INa、IK和If(Verheijcketal.)。在本次研究揭露的硝苯地平的效应包括：（1）减缓了心外膜APD90的延长并以此（2）恢复了KCNE1-/-组显著改变的△APD90，使其与未进行医治的无心律失常产生的WT组的△APD90值相近，（3）抑制了在自主节律和突然中断的持续性室性起搏下产生的全部EADs，（4）减少了PES所引发的VT，（5）抑制了仅在KCNE1-/-组心外膜产生的APD交替。同时本研究并没有排除其它因素对Ca2+稳态的改变，而其中影响Ca2+稳态的因素通常为ICa的改变，实验中ICa的改变支持了先前的推测：（1）可能由于KCNE1-/-组KCNE1基因敲出后所致使的IK减少引发了复极末期ICa和IK的失衡并由此引发了心律失常的产生。（2）由于L型Ca2+通道的再活化，复极末期ICa和IK的失衡可能会致使EADs。（3）KCNE1-/-组观测到的使用二氢吡啶类L型钙通道拮抗剂硝苯地平的抗心律失常的效应可能是通过恢复了ICa和IK的平衡所取得的(Balasubramaniametal.)。虽然维拉帕米不仅是L型Ca2+通道（ICa,L）的拮抗剂(Triggle,)还是IKr的拮抗剂(Chouabeetal.;Zhangetal.)，但是这类观测ICa和IK的平衡的方案也一样适用于其他使用苯基烷胺类抗心律失常药维拉帕米的研究包括临床病例(Cosioetal.;Shimizuetal.;Komiyaetal.)和LQTS的动物模型(Aibaetal.;Milbergetal.)中。遗憾的是目前唯一很少的一致数据支持临床上使用Ca2+通道拮抗剂来抑制室性心律失常。在预测氨氯地平生存评估的随机实验（PRAISE）中确切报导过氨氯地平显著的下降了非缺血性心衰病人的猝死(Packeretal.)，但是随后的PRAISE-2研究中却没法证实此观点(Thackrayetal.)。尽管如此，使用Ca2+通道拮抗剂来抑制室性心律失常的观点可能值得进一步在临床实践中证实。
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